PRACTICA Nº.8

TriniCLOT aPTT S

APLICACIÓN:

Es un equipo de prueba que se utiliza en la determinación del tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA) y que consiste de un reactivo fosfolípido con activador en partículas y un reactivo de cloruro de calcio.

RESUMEN Y EXPLICACIÓN DE LA PRUEBA:

La prueba de tiempo de tromboplastina parcial activada es un procedimiento de screening universalmente aceptado que se utiliza para detectar anomalías en el sistema intrínseco de coagulación. Puede utilizarse también en pruebas de factores para detectar deficiencias de los factores II, V, VIII, IX, X, XI y XII, pero es insensible al factor plaquetario. Además puede utilizarse para detectar el anticoagulante de Lupus y se recomienda para controlar la terapia con heparina ya que es sensible a la presencia de esta. La prueba de TTPA no se recomienda para controlar la terapia  con anticoagulantes orales ni es sensible a la disfunción plaquetaria. Estas condiciones se controlan mejor mediante la prueba de tiempo de protrombina o una prueba de tiempo de sangrado, respectivamente.

El reactivo de TriniCLOT aptt s se mezcla con plasma del paciente para proporcionar una activación uniforme óptima de la muestra.

Después de la activación a 37°c durante 5 minutos se inicia la reacción añadiendo CaCi2 TriniCLOT aPTT S. se mide en segundos el tiempo necesario para la formación de coagulación.

MATERIALES:

1.       Micropipeta con puntas desechables 0.1 mL

2.      Plasmas control

3.      Plasma de referencia y plasma deficiente en factor (para pruebas de factores)

4.      Instrumentación para coagulación

5.      Micropipetas

6.      Plasmas de control triniCHECK

7.      Plasma de referencia triniCAL

8.     Plasmas deficientes en factores

PROCEDIMIENTO DE LA PRUEBA:

1.       Calentar previamente a 37°c un volumen suficiente de reactivo TriniCLOT aPTT S y CaCi2 TriniCLOT aPPT S.

2.      Etiquetar un tubo de ensayo para cada muestra (paciente y control) a analizar.

3.      Pipetear 0.1 mL de muestra o control al tubo adecuado; a continuación, pipetear 0,1 mL de Reactivo TriniCLOT aptt s a cada tubo.

4.      Después de la activación pipetear inmediatamente a cada tubo 0.1 mL de CaCi2 TriniCLOT aPTT S previamente calentado e iniciar simultáneamente el cronometraje para la detección de la coagulación mediante un método de detección conveniente. Anotar el tiempo, en segundos, transcurrido hasta que se detecta coagulación.

NOTAS DEL PROCEDIMIENTO Y PRECAUCIONES:

1.       Al fin de obtener un funcionamiento adecuado del reactivo, debe utilizarse CaCi2 TriniCLOT aPPT S en combinación con Reactivo TriniCLOT aPPT S. No sustituir el CaCi2 TriniCLOT aPPT S por otros reactivos de cloruro de calcio. Los reactivos deben de corresponder específicamente con el lote de equipo para asegurar un funcionamiento óptimo. No mezclar los reactivos de diferentes lotes de quipo.

2.      Se recomienda efectuar las determinaciones por duplicado para los métodos manuales.

3.      Es importante utilizar material de vidrio (o de plástico) limpio. La superficie del contenedor y el área superficial pueden alterar la activación de las muestras. Se recomienda seguir una misma técnica en todos los procedimientos de coagulación.

4.      La siguiente secuencia es adecuada para realizar una prueba de tiempo de tromboplastina parcial activada; para las determinaciones automáticas seguir las instrucciones específicas que acompañan al instrumento utilizado

RESULTADOS:

El tiempo obtenido (en segundos) es el tiempo de tromboplastina parcial  activada del  paciente.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:

Aunque con TriniCLOT aPTT S pueden utilizarse casi todos los métodos manuales y automáticos para la detección de la coagulación, los diversos métodos pueden detectar puntos finales ligeramente distintos. Deben tomarse oportunas precauciones al comparar resultados obtenidos con métodos distintos.

El plasma de algunos pacientes con alto contenido en fibrinógeno muestra en aumento de turbiedad tras añadirle cloruro de calcio, lo que puede originar, antes de la formación real de coagulo, un registro del tiempo de coagulación al usarse un sistema óptico de detección. No obstante, el tiempo real de coagulación no queda afectado por ello, lo cual permite la obtención de un ttpa terapéuticamente  apropiado usando un método no óptico. Los plasmas cuyo resultado de punto final  de ttpa óptico es inferior a 22 segundos, con valores ampliamente discrepantes o incongruentes con el curso de la terapia del paciente, deberán ser identificados y controlados nuevamente con un sistema de detección de punto final no óptico.

RESULTADOS:

MUESTRA 1

12 SEGUNDOS

MUESTRA 2

16 SEGUNDOS 

PRACTICA Nº.7

TriniCLOT FIBRINÓGENO

El kit de TriniCLOT Fibrinógeno está diseñado para la determinación cuantitativa del fibrinógeno en plasma. 

RESUMEN:

La mayoría de los métodos para determinar la concentración de fibrinógeno asumen que la trombina convertirá cuantitativamente el fibrinógeno a fibrina. La estimación de la concentración en base al peso o contenido proteico del coágulo de fibrina formado puede estar sujeta a importantes errores debido a la presencia de inhibidores que provocarán la formación de coágulos pequeños o ausencia de coágulos. La plasmina también puede producir lisis significativa del coágulo formado antes de que pueda ser completada la determinación final de fibrinógeno. Se han descrito procedimientos alternos basados en la precipitación con sulfato de amonio5, 6 pero estos no correlacionan con los tiempos de coagulación de la trombina cuando los niveles de fibrinógeno están por debajo de 100 mg/dl (1.0 g/L)

PREPARACIÓN DEL REACTIVO:

Reconstituya el TriniCAL Fibrinógeno con 1,0 ml de agua destilada o desionizada. Tape de nuevo el vial y déjelo reposar hasta que esté completamente disuelto. Inviértalo suavemente para mezclarlo. NO LO AGITE. 

Reconstituya el reactivo de trombina con 6,0 ml de agua destilada o desionizada. Tape de nuevo vial y déjelo reposar hasta que esté completamente disuelto. Inviértalo periódicamente. NO LO AGITE.  El tampón de imidazol se suministra como un líquido y no requiere preparación antes de su uso.

ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES

Se deben seguir las precauciones normales establecidas para el manejo de reactivos en el laboratorio. Deseche los residuos de acuerdo con la legislación local, nacional y regional.

El TriniCAL Fibrinógeno es un MATERIAL QUE PODRÍA SUPONER UN RIESGO BIOLÓGICO.

Métodos de prueba aprobados indican que los materiales originales de los que deriva este producto muestran resultados negativos de AgHBs, así como anticuerpos contra el VHC, el VIH-1 y el VIH-2. Sin embargo, como no hay ningún método de prueba que pueda garantizar por completo que no existan agentes infecciosos, este producto deberá manejarse cumpliendo las mismas precauciones de seguridad que cuando se manipula material potencialmente infeccioso.  El reactivo de trombina es NOCIVO. Produce daños si entra en contacto con la piel o si se ingiere. Produce irritación en los ojos, en el sistema respiratorio y en la piel. En caso de contacto con los ojos, lávelos inmediatamente con abundante agua y consulte a un médico. Lleve ropa de protección adecuada. La ausencia de vacío al abrir un vial de reactivo de trombina o TriniCAL Fibrinógeno, o la incapacidad para obtener valores reproducibles son posibles signos de deterioro del producto.

El tampón de imidazol contiene acida de sodio, que es NOCIVA. Produce daños si entra en contacto con la piel o si se ingiere. El contacto con ácidos libera un gas muy tóxico. Mantenga el contenedor herméticamente cerrado. Lleve ropa y guantes protectores adecuados. MATERIAL CON RIESGO BIOLÓGICO POTENCIAL. La acida de sodio puede reaccionar con piezas de plomo y cobre, dando como resultado acidas metálicas altamente explosivas. Evite la acumulación de acidas. Deseche el tampón de imidazol si hay signos de crecimiento microbiano.

MÉTODO DE BBL FIBROMETER:

Curva de calibración y prueba del plasma del paciente:

1. Reconstituya el reactivo de trombina y manténgalo a temperatura ambiente (18-25°C) durante la prueba.

2. Añada 0,2 ml (200 µl) de la muestra de plasma diluida a una copa de Fibrometer.

3. Incube durante 1–3 minutos a 37°C. (No más de 5 minutos.)

4. Después de la incubación, extraiga rápidamente 0,1 ml (100 µl) del reactivo de trombina en la copa de Fibrometer y, al mismo tiempo, active el cronómetro.

5. Anote los resultados del tiempo de coagulación en segundos.

6. Extrapole la concentración a partir de la curva de calibración.

Las sondas deben lavarse y secarse entre una prueba y otra para evitar el arrastre de proteínas plasmáticas activadas. Para una limpieza eficaz, las sondas de Fibrometer deben sumergirse en agua y frotarse CON FUERZA después de cada determinación. No basta con secarlas con papel secante. 

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS:

La dilución más baja recomendada de la prueba es 1:3. No se puede emplear plasma sin diluir, ya que los inhibidores y las sustancias que interfieren pueden afectar a la precisión de los resultados.

El tiempo de medición más cortó para el instrumento KC 1/KC 4 es de unos 4,5 segundos. Cuando obtenga un tiempo de coagulación de 4,5 segundos, vuelva a ejecutar la muestra con una dilución diferente.

Los resultados no se ven excesivamente afectados por niveles terapéuticos de heparina habituales (hasta 3,0 USP U/ml) detectados en pacientes anti coagulados. Se ha indicado que los productos de degradación de la fibrina (PDF) pueden inhibir la acción de la trombina sobre el fibrinógeno y la polimerización de la fibrina. Los PDF tienen un efecto mínimo en un ensayo de fibrinógeno con niveles normales de fibrinógeno. En concentraciones de fibrinógeno por debajo de 150 mg/dl (1,5 g/L), una concentración de PDF superior a 100 g/ml puede inhibir en mayor medida el ensayo de Clauss.

RESULTADOS:

MUESTRA 1

1 MINUTO

MUESTRA 2

1 MINUTO, 7 SEGUNDOS

 CONCLUSIÓN:

 Las prácticas a realizar estuvieron muy sencillas y gracias a ellas pudimos saber cómo se  lleva a cabo dichas prácticas.

Vo.Bo. DEL PROFESOR

DR.VICENTE MARTÍNEZ FRAGOSO